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ISSN : 1976-6769(Print)
ISSN : 2287-8122(Online)
Korean Journal of Nature Conservation Vol.7 No.1 pp.35-41
DOI : https://doi.org/10.11624/KJNC.2013.7.1.035

조경수종인 소엽맥문동(Ophiopogon japonicus (L.f.) Ker Gawl)의 캘러스 유도 및 식물체 재분화

배기화1, 윤의수2*
1(재)홍천메디칼허브연구소, 2공주대학교 생명과학과

Callus Induction and Plant Regeneration from Ophiopogon japonicus (L.f.) Ker Gawl in Ornamental Species

Eui-Soo Yoon2*, Kee Hwa Bae1
2Department of Biology, College of Nature Sciences, Kongju National University, Kongju 314-701, Korea
1Hongcheon Institute of Medicinal Herb, 101 Yeonbong-ri, Hongcheon-eup, Hongcheon, Gangwon 250-930, Korea
(Received 6 May 2013; Revised 30 May 2013; Accepted 8 June 2013)

Abstract

A method for rapid micropropagation of Ophiopogon japonicus through plant regeneration from leaf,rhizome and root explants derived calli has been developed. Leaf, rhizome and root segments were cultured onMurashige and Skoog (MS) medium supplemented with plant growth regulators (2,4-D, NAA, IAA; 0~3.0 mg/L) for callus induction. Callus production was highest at 1.0 mg/L 2,4-D where 91%. These calli weretransferred to MS medium supplemented with various concentrations of 2,4-D (0, 0.5, 1.0, 3.0 mg/L) incombination with 6-benzyladenine (BA: 0, 0.5, 1.0 and 3.0 mg/L) for adventitious shoot regeneration. Theaddition of low concentration of 2,4-D into BA containing medium significantly increased the frequency ofshoot regeneration in both leaf, rhizome and root derived calli. The highest frequency of adventitious shoot(88%) formation was on MS medium supplemented with 0.5 mg/L 2,4-D and 1.0 mg/L BA. For rooting of theshoots, half-strength MS medium supplemented with different concentrations of plant growth regulators (2,4-D,IBA, NAA) 0, 0.1, 1.0, 3.0 mg/L was tried. The optimal results was observed on half-strength MS mediumsupplemented with 3.0 mg/L NAA (average of 42.9 roots per explant). In vitro raised plantlets wereacclimatized and transferred to soil with 100% success. This in vitro propagation protocol would be useful forconservation as well as mass propagation of this medical plant.

35-41_N62-배기화.pdf634.3KB

1. 서 론

 일반적으로 조경수종(ornamental species)은 교목, 관목, 화목류 등 다양한 수종이 개발, 도입, 식재되고 있으나 수목식재장소 이외의 공간을 차지하는 나지를 덮어 줄 수 있는 지피식물의 개발과 연구는 미진한 편이다. 지피식물은 먼지발생감소, 미세기후조절능력, 경관친화형 휴식공간확보, 우수(雨水)에 의한 침식방지능 등의 효과로 인해 최근 그 중요도가 점점 증가하고 있다. 현재 일반적으로 쓰이고 있는 지피식물은 잔디(grass)인데 이는 내음성이 약하고 낙엽성이기 때문에 이용에 한계가 있어 새로운 지피소재의 개발이 절실히 요구되고 있다. 한편, 잔디 외에는 비록 소량이기는 하지만 조개나물(Ajuga multiflora Bunge), 비비추(Hosta longipes Matsum), 돌나물(Sedum sarmentosum Bunge), 일일초(Madagascar periwinkle Schum), 금은화(Lonicera caerukea Thunb), 담쟁이(Hedera helix Planch), 수호초(Pachysandra terminalis Siebold & Zucc), 맥문동(Liriope platyphylla F.T. Wang & T. Tang), 맥문아재비(Ophiopogon jaburan Lodd.) 등이 실내·외 조경공간에 식재되어 이용되고 있다(Sul et al., 1997).

이중 소엽맥문동(Ophiopogon japonicus (L.f.) Ker Gawl)은 백합과(Liliaceae)에 속하는 상록성 다년초로서 주로 산지의 나무그늘에 자생하며 일본과 한국이 원산지이다(이영노, 2006). 내음성과 내습성 그리고 내염성이 강하고 저온에 잘 견디며, 번식력도 강해서 교목의 그늘이나 실내외 조경용 지피식물로 많이 이용되고 있다(Flint, 1983). 맥문동은 엽장 30~50 cm, 엽폭 10 mm인데 비해 소엽맥문동은 엽장 10~20 cm, 엽폭 4 mm이기 때문에 매우 조밀하게 식재할 수 있다(Fantz, 1994; 이창복, 1993). 내한성은 강한 편으로 알려져 있지만(Wyman, 1979), 한반도의 중부 이북지방에서는 노지월동 시 잎이 갈변하고 이후 생육이 불량해지는 등의 단점이 있다. 

 한편, 맥문동은 형태적, 세포유전학적 특성에 따라 맥문동속의 개맥문동, 맥문동과 맥문아재비속의 맥문아재비, 소엽맥문동 등으로 다양하게 분화되어 있다(Shin et al., 2002). 이런 맥문동은 항산화 작용, 혈류량 촉진, 심장 수축력 증가, 진정, 면역 증강, 혈당강하, 항균 작용 등 효능이 지속 보고되고 있는데 그 중 소엽맥문동에 steroid 사포닌, flavonoid, sterol, oligsaccharide 및 polysaccharide 등이 분리, 보고되어있다(Baek et al., 1998).

 하지만 맥문동 및 소엽맥문동의 조직배양을 통한 기내증식에 관한 연구는 매우 미비한 실정이다.

 따라서 본 연구에서는 소엽맥문동의 캘러스 유래 기내 식물체 재분화에 미치는 식물생장조절물질의 영향에 대해 조사하여 기내에서 대량으로 증식하고 향후 지속가능한 생태계 유지에 필요한 개체의 증식과 자생지외 조경수종으로서 원종공급을 위해 실험을 수행하였다.

2. 연구 방법

2.1. 식물재료 및 배양환경

 실험에 사용한 소엽맥문동(O. japonicus)은 2010년 6월 제주도 서귀포시 남원읍에 소재한 사려니오름에서 채집한 20개의 종자를 사용하였다. 종자는 종피를 제거 한 후 멸균된 증류수에 1시간 침지시킨 다음 70% EtOH에 1분간 표면살균 한 후 3% sodium hypochlorite 용액에 20분간 침지하였다. 그리고 멸균된 종자를 멸균된 증류수로 5회 이상 수세한 후 마지막 단계에서 5분간 침지하여 sodium hypochlorite 용액을 완전히 제거한 후, 멸균된 filter-paper 위에 올려놓아 물기를 제거하였다. 발아 배지는 1/3MS (Murashige and Skoog, 1962)에 30 g/L sucrose와 3.0 g/L gelrite를 첨가한 배지를 사용하였다. 모든 배양은 온도 22 ± 1℃, 광주기 16/8시간, 광도 46 μmol m−2s−1의 배양실에서 배양하였고, 실험에 사용한 모든 배지와 기구는 121℃, 1.5기압으로 20분간 고온·고압 멸균하여 페트리디쉬는 30 ml, 4각 plastic 배양병(SPL, Korea)에 각각 100 ml씩 배지를 분주하여 실험에 사용하였다.

2.2. 배양부위 및 식물생장조절물질 농도에 따른 캘러스 유도

 소엽맥문동의 종자발아체로부터 캘러스를 유도하기 위해 뿌리, 근경, 잎을 각각 1 × 1 cm로 횡절단하였다. 절단된 소엽맥문동의 뿌리, 근경, 잎 부위는 medium의 농도는 MS를 기본으로 하고 0, 0.5, 1.0, 3.0 mg/L 2.4-D(2,4-Dichlorophenoxy acetic acid), NAA(Naphthalene acetic acid), IAA(Indole acetic acid)를 각각 단용 처리한 배지에 30 g/L의 sucrose, 교질재료로는 plant agar 8 g/L를 첨가하여 제조된 배지위에 치상하였다. 배양 4주 후 캘러스유도율과 크기를 조사하였다.

2.3. 배양부위 유래 캘러스의 재분화 조건

소엽맥문동의 배양부위 유래 캘러스로부터 신초형성에 미치는 식물생장조절물질을 확인하기 위해 각각의 부위로부터 유도된 캘러스를 분리하여 0, 0.5, 1.0, 3.0 mg/L BA(Benzylamino purine)와 2,4-D를 각각 0, 0.5, 1.0, 3.0 mg/L를 혼용 처리된 MS배지에 치상하여 6주간 배양한 다음 신초유도율과 신초길이를 조사하였다. 

2.4. 발근 및 토양순화

 기내뿌리유도를 통한 효과적인 식물체 생장 및 순화를 위해 각각의 초장이 5~8 cm로 신장된 신초를 분리하였다. 분리된 식물체에서 기내 뿌리유도에 효과적인 조건을 확인하기 위해서 1/2MS 배지에 30 g/L의 sucrose를 첨가하고 0, 0.1, 1.0, 및 3.0 mg/L의 2,4-D, IBA(Indole-3-butyric acid) 및 NAA를 단용 처리한 배지위에 소엽맥문동 유식물체를 치상하였다. 실험에 사용한 개체는 5개체씩 3반복하였으며 6주 후에 발달된 뿌리의 수와 길이를 각각 조사하였다. 초장 6~10, 근장 3 cm로 기내에서 생장이 양호하고 정상적으로 뿌리와 줄기가 발달한 식물체를 토양 순화하여 소엽맥문동의 식물체를 생산하였다.

2.5. 통계분석

 모든 데이터는 means ± standard deviation으로 표시하였다. 변이들의 집단간 차이를 알아보기 위해서 one-way ANOVA를 실시하였고, 유의성이 있는 경우 Duncan's multiple range test로 사후검증을 하였다. 통계적 유의성은 P < 0.05로 설정하여 분석하였다.

3. 결 과

3.1. 배양부위 및 식물생장조절물질(auxins) 농도에 따른 캘러스 유도

 기내 조직배양을 통한 재분화 시스템의 확립은 초기 배양재료의 선택이 중요하다. 소엽맥문동 역시 효과적인 재분화 시스템을 확립하기 위해 잎(leaf), 근경(rhizome), 뿌리(root)부위 및 옥신종류 및 농도에 따른 캘러스 유도율을 조사하였다. 캘러스유도 조건을 조사하기 위해 종자에서 발아된 유식물의 잎, 근경, 뿌리를 절단하여 2,4-D, NAA, IAA가 첨가된 배지에서 4주간 배양한 결과, NAA, IAA를 첨가한 배지에서는 소엽맥문동의 잎, 뿌리, 근경절편 모두에서 홀몬무첨가 배지(그림 1A)와 같이 변화가 없었고, 2,4-D를 첨가한 배지에서는 배양 2주부터 절단면이 부풀어 오르기 시작하여, 배양 3주째부터 잎(그림 1B), 근경(그림 1C), 뿌리(그림 1D)에서 모두 노란색의 캘러스가 형성되기 시작했고, 4주후 캘러스의 유도을 확인하였다. 캘러스의 유도와 증식은 2,4-D가 첨가가 되면 잎, 근경, 뿌리부위 모두에서 일어났지만, 근경과 뿌리부위는 잎 부위보다 캘러스 유도율이 1.5 배 이상 높았고 크기도 2~4배 이상 비대해 짐을 확인하였다(표 1). 이와 같이 배지에 첨가하는 생장조절물질과 배양부위는 재분화 시스템 확립의 완성도를 높이는데 많은 영향을 미치는 것으로 사료된다. 참돌꽃(Rhodiola rosea L.)의 경우, 잎절편을 치상하여 BA와 NAA가 복합적으로 처리가 되었을 때 부정아 및 캘러스 유도율이 가장 우수하다는 결과를 보고하였고(Bae et al., 2005), 또한 난과 식물인 새우난초(Calanthe discolor)의 조직배양을 통한 식물체 생산에서도 새우난초의 배양부위(잎, 구경, 뿌리)에 따라 부정아유도율과 캘러스 유도율이 다르고 식물체 재생율에 많은 영향을 주는 것으로 보고되었다(Bae et al., 2010). 이와 같이 배양부위 및 배지에 첨가하는 생장조절물질의 종류와 농도에 따라 캘러스 유도 및 신초분화 양상이 다르게 나타남을 알 수 있다(Ryu et al., 1992). 신초의 분화 및 생장에는 세포의 생장과 분열을 촉진하는 생장조절물질의 첨가가 필수적이며, 배양부위의 분열부위 존재 유무 등이 초기배양의 성패를 좌우하는 중요한 인자로 작용하는 것으로 사료된다.

Figure 1. Induction of callus of explants from O. japonicus. (A) Control, (B) Leaf on 1.0 mg/L 2,4-D, (C) Rhizome on 1.0 mg/L 2,4-D, (D) Root on 1.0 mg/L 2,4-D in MS medium after 4 weeks of culture, Scale bar = 1 mm.

Table 1. Effect of plant growth regulators (auxins) on callus formation from leaf, rhizome and root of O. japonicus after 4 weeks.

3.2. 소엽맥문동의 신초발달에 미치는 식물생장조절물질의 영향

 소엽맥문동의 기내 재분화체를 생산하기 위해 자엽, 근경, 뿌리로부터 유도된 캘러스(그림 2A)를 2,4-D와 BA를 혼합 처리한 MS배지에 치상하여 신초유도율을 조사하였다. 유도된 캘러스를 생장조절물질이 첨가되지 않은 MS배지에 배양하였을 때는 신초의 유도는 전혀 일어나지 않았고, 배양 3주부터 부정근이 일부 관찰되었다. 또한 잎, 근경, 뿌리유래 캘러스는 1.0 mg/L 2,4-D 혼용과 1.0 mg/L BA 혼용 처리 시 shoot의 유도가 이루어 졌는데 2,4-D 단용처리 보다 BA를 혼용 처리 하였을 때 20% 높은 유도율을 확인 할 수 있었다(표 2). BA가 혼용 처리되면 캘러스는 2주 후부터 초록색으로 캘러스가 변화되며 shoot primordia로 전환되는 것을 확인하였고 초록색으로 변화된 캘러스는 종자발아체의 자엽과 비슷한 형상을 지니며 분화되기 시작하였다(그림 2B). 분화가 시작된 캘러스는 약 6~7주 후에 잎이 3 cm 이상 분화하여 식물체의 모습으로 변화하였다(그림 2D). 하지만 0.5 mg/L BA와 0.5 mg/L 2,4-D를 처리한 실험구는 시간이 지나면서 shoot primordia가 형성은 되지만 엽록소가 침적이 되지 않음을 확인하였고(그림 2C), 엽록소가 침적이 되지 않으면 4주후 고사됨을 알 수 있었다. 이는 과는 다르지만 붓꽃과 식물의 재분화에 있어서 사이토키닌류인 BA가 부정아의 유도 및 분화에 가장 효과적인 생장조절물질로 보고되고 있고 (Hussey, 1976; Meyer and van Staden, 1998; Shibli and Ajlouni, 2000; Koh, 2005; Madubanya et al., 2006), 본 연구결과와 동일한 연구결과를 보여주고 있다. 또한, 초기 배양부위 유래 캘러스의 계속적인 활용으로 뿌리유래 캘러스가 식물체의 분화에도 좋은 효과를 지니는 것으로 확인하였다(표 2).

Figure 2. Regeneration of callus from O. japonicus. (A) Callus from rhizome, (B) Callus from rhizome on 1.0 mg/L BA combined with 0.5 mg/L 2,4-D, (C) Callus from rhizome on 0.5 mg/L BA combined with 0.5 mg/L 2,4-D, (D) Regenerated plantlet from callus on 1.0 mg/L BA combined with 0.5 mg/L 2,4-D in MS medium after 4 weeks of culture, Scale bar = 1 mm.

Table 2. Effect of BA and 2,4-D concentration on shoot formation and size from leaf, rhizome and root of O. japonicus callus after 6 weeks of culture.

3.3. 소엽맥문동의 기내발근 및 토양순화

 신초의 증식과정을 통해 얻어진 유식물체의 효율적인 생장과 뿌리발달을 이루기 위해 발근에 적합한 배지를 조사하였다. 1/2MS 배지에 2,4-D, IBA 및 NAA를 각각 0.1, 1.0, 3.0 mg/L 단용 처리하여 6주간 배양한 결과는 표 3과 같다. 뿌리를 포함하지 않는 소엽맥문동의 유식물체는 생장하며 발근이 이루어졌는데 NAA 처리구에서는 식물체당 발근 형성개수는 배양 6주까지 약 22.6개 이상 유도가 되었다. 유도된 뿌리의 길이는 1.0 mg/L의 IBA가 첨가된 배지에서 8.4 cm로 가장 높았고 옥신을 처리하지 않은 대조구 및 2,4-D가 첨가된 배지에서는 발근이 이루어지지 않았다(표 3). 본 실험에 사용한 소엽맥문동의 경우 초기(배양 4주) 발근율이 다른 식물에 비해 현저히 낮았다. Chung 등(1998)은 심비디움(Cymbidium spp.)의 생장점 배양을 통한 다신초 유도시 옥신을 처리할 경우 발근율이 50% 증가한다는 보고를 하였다. 그러나 Malabadi 등(2004)은 Vanda coerulea에서, Emst(1994)는 Doritaenopsis와 Phalaenopsis에서 식물생장조절제의 농도가 높은 배지에서 생장, 분화된 신초일수록 발근율이 감소한다고 하였다. 일반적으로 기내배양체(초본, 목본류)의 발근은 토양순화 시 토양활착을 양호하게 하기 위한 전단계로 정상적인 기내발근이 이루어져야 토양순화 후 배양체가 생존할 확률이 높아지는 것이다. 하지만 내생옥신(endogenous auxin)이 많은 식물의 경우 식물생장조절물질이 첨가되지 않은 배지에서도 발근이 잘 이루어지는 것으로 알려져 있다. 특히 목본류인 개느삼(Echinosophora koreansis)과 팔손이(Fatsia japonica), 초본류인 고추나물(Hypericum erectum)의 경우 옥신류 식물생장조절물질 무첨가 배지에서도 20~50% 이상의 발근률을 보였다(Choi et al., 2005; Kim et al., 2006; Moon and Kim, 2008). 이는 수종은 다르지만 우선 소엽맥문동은 내생옥신이 다른 식물에 비해 적음을 유추할 수 있는 결과로 사료된다. 기내배양 식물의 효율적인 토양순화는 실용화(산업화)의 측면에서 매우 중요한 요인이다. 유용한 성분을 함유하고 있는 식물과 희귀 및 멸종위기종의 경우 특히 더 중요하다. 소엽맥문동의 기내 발근 후 4주후에 순차적 순화를 통해 포트(그림 3C)에 이식한 결과 100%의 생존율을 확인 할 수 있었다.

Table 3. Effect of auxins concentration on root induction from plantlet of O. japonicus after 6 weeks of culture.

Figure 3. Plant regeneration from callus derived rhizome of O. japonicus. (A) Development of root on MS medium supplemented 3.0 mg/L 2,4-D after 4 weeks of culture, scale bar = 4 mm, (B) Development of root on MS medium supplemented 1.0 mg/L NAA after 4 weeks of culture, scale bar = 3 mm, (C) Acclimatized plantlet in pot, scale bar = 10 cm.

 따라서 본 연구결과에서 소엽맥문동 유식물체를 이용하여 각각의 부위(잎, 근경, 뿌리) 및 옥신종류 및 농도에 따른 최적의 캘러스 유도조건을 조사하였고, 유도된 캘러스를 이용하여 분화에 최적인 사이토키닌 농도를 확인하였다. IBA와 NAA의 농도에 따른 발근율을 조사하여 성공적인 기내배양을 통한 재분화 시스템을 확립하였다. 또한 토양순화를 통한 재분화체의 서식지외 보존기술 적용 시스템을 확립하였다. 이러한 결과는 향후 소엽맥문동의 형질전환을 통한 품종개량이나 유용한 유전자를 통한 형질전환 식물체의 개발에 중요한 기초자료를 제공할 것으로 생각된다.

4. 결 론

 조경수종인 소엽맥문동의 재분화에 미치는 식물생장조절물질의 영향에 관해 연구 하였다. 캘러스 유도에 미치는 식물생장조절물질을 확인하기 위해 2,4-D, NAA, IAA 각각 농도별로 처리한 단용배지에서 소엽맥문동의 잎, 근경, 뿌리를 배양하였다. 2,4-D가 처리된 배지에서는 잎, 근경, 뿌리 모두에서 캘러스가 유도되었고, NAA와 IAA가 첨가된 배지에서는 잎, 근경, 뿌리 모두에서 캘러스 형성이 이루어지 않았다. 캘러스유래로부터 식물체의 재분화 조건은 0.5 mg/L 2,4-D와 1.0 mg/L BA가 혼합 처리된 실험구에 뿌리유래 캘러스를 배양하였을 때 88%의 높은 신초 분화율을 확인하였다. 신초발달 이후 뿌리발달을 통한 건전식물체 생산은 토양순화의 전단계에서 중요한 요인으로 작용하는데 이를 성공적으로 수행하기 위해 IBA와 NAA의 농도에 따른 발근율을 조사하였다. 발근은 대조구에 비해 1.0 mg/L IBA 처리구는 절편당 뿌리길이가 평균 8.4 cm, 3.0 mg/L NAA 처리구는 절편당 유도갯수가 42.9개로 가장 양호하였다. 토양순화는 발근이 성공적으로 이루어진 소엽맥문동 유식물체 80개를 포트묘로 순화하였다. 결과적으로 본 연구는 소엽맥문동의 재분화체 생산시 배양부위, 식물생장조절제의 영향등에 관해 구체적인 결과를 제시하였고, 이러한 결과는 특산식물 또는 멸종위기 식물의 보전 및 생산에도 중요한 기초자료로 제공될 것으로 사료된다.

Reference

1.Bae, K. H. Yoon, E. S. Yun, P. Y., and Y. E. Choi. 2010. Soil acclimatization of Calanthe discolor throught multiple shoot formation from tissue culture. Kor. J. Plant Res. 23(1): 7-13.
2.Bae, K. H., Yoo, J. A., and Yoon, E. S. 2005. Effect of growth regulators of plant regeneration from Rhodiola sachalinensis leaf segments. Kor. J. Plant Res. 18(3): 410-416.
3.Baek, N. I., Cho, S. J., Bang, Y. H., Lee, I. J., Park, C. G., Kim, M. S., Kim, K. S., and Sung, J. D. 1998. Cytotoxicity of steroid-saponins from the tuber of Liriope platyphylla W.T. J. Kor. Soc. App. Bio. Chem. 41: 390-394.
4.Choi, K. M., Hwang, S. J., Ahn, J. C., Lee, H. Y., Kim, J. H., and Hwang, B. 2005. In vitro propagation from axillary bud explants of Fatsia japonica Deene. et Planch. Kor. J. Med. Crop Sci. 13(6): 300-303.
5.Chung, J. D., Lee, J. H., Jee, S. O., and Kim, C. K. 1998. Effect of medium composition on multiple shooting and subsequent growth of mericlone from rhizome of shoot tip cultures of temperate Cymbidium species. J. Kor. Hort. Sci. 39(3): 343-349.
6.Emst, R. 1994. Effects of thidiazuron on in vitro propagation of Phalaenopsis and Doritaenopsis (Orchidaceae). Plant Cell Tiss. Org. Cult. 39: 273-275.
7.Fantz, P. R. 1994. A taxonomic research update of cultivated liriopogons. Hort. Tech. 4: 46-48.
8.Flint, H. L. 1983. Landscape plants for eastern north America-exclusive of Florida and the immediate Gulf coast. John Wiley & Sons. New York.
9.Hussey, G. 1976. In vitro release of axillary shoots from apical dominance in monocotyledonous plantlets. Ann. Bot. 40: 1323-1325.
10.Kim, M. L., Nam, D. W., Ahn, J. C., and Hwang, B. 2006. Micropropagation of Hypericum erectum by axillary bud culture. Kor. J Med. Crop. Sci. 14: 23-26.
11.Koh, J. C. 2005. Callus culture and plant regeneration from shoot apex of Iris Sanguinea Donn ex. Horn. J. Plant Biotechnol. 3(1): 93-98.
12.Lee, C. B. 2003. Coloured flora of Korea. Hangmoonsa.
13.Lee, Y. N. 2006 New taxa on Korean flora (1), Korean Jour. Botany 17(1): 33-35.
14.Madubanya, L. A., Makunga, N. P., and Fennell, C. W. 2006. Dierama luteoalbidum : liquid culture provides an efficient system for the ex situ conservation of an endangered and horticulturally valuable plant. S. Afr. J Bot. 72: 584-588.
15.Malabadi, R. B., Mulgund, G. S., and Nataraja, K. 2004. Efficient regeneration of Vanda coerulea, an endangered orchid using thiadiazuron. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 76: 289-293.
16.Meyer, H. J. and van Staden, J. 1998. In vitro multiplication of Ixia fkexuosa. Hort. Sci. 23: 1070-1071.
17.Moon, H. K. and Kim, Y. W. 2008. In vitro propagation of a rare and endangered species, Echinosophora koreensis Nakai. by axillary bud culture. Kor. J. Plant Biotechnol. 35: 229-234.
18.Murashige, T. and Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497.
19.Shibli, R. A. and Ajlouni, M. M. 2000. Somatic embryogenesis in the endermic Black Iris. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 61: 15-21.
20.Shin, J. S., Kim, W. H., and Kim, J. H. 2002. Ecological characteristics of the genus Ophiopogon and Liriope in Korea. Kor. J. Ecol. 25: 21-31.
21.Sul, J. H., Cho, K. H., Hong, J., Pak, C. H., Lee, K. M., and Kwack, B. H. 1997. Effect of soil mulching and root-cut treatments on winter growth of Ophiopogon japonicus. J. Kor. Soc. Hort. Sci. 38(1): 81-85.
22.Ryu, J. H., Doo, H. S., and Kwon, T. H. 1992. Induction of haploid plants by anther culture in sesame (Sesaum indicum L.). Kor. J. Plant Biotech. 19: 171-177.
23.Wyman, D. 1979. Wyman's gardening encyclopedia. Macmillan Publishing Co. Inc. New York.