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ISSN : 1976-6769(Print)
ISSN : 2287-8122(Online)
Korean Journal of Nature Conservation Vol.6 No.2 pp.87-93
DOI : https://doi.org/10.11624/KJNC.2012.6.2.87

자생식물 노랑꽃창포(Iris pseudoacorus L.)의 캘러스 유도 및 식물체 재분화

배기화1, 유경화2, 윤의수2*
1(재)홍천메디칼허브연구소 2공주대학교 생명과학과

Callus Induction and Plant Regeneration from Iris pseudoacorus L. in Native Plant

Eui-Soo Yoon2*, Kee Hwa Bae1, Kyoung Hwa Yoo2
2Department of Biology, College of Nature Sciences, Kongju National University, Kongju 314-701, Korea
1Hongcheon Institute of Medicinal Herb, Gangwon 250-930, Korea
(Received 13 July 2012; Revised 6 November 2012; Accepted 12 November 2012)

Abstract

This experiments were carried out to find out the effects of different explant materials, kinds andconcentration of plant growth regulators on the in vitro regeneration of Iris pseudoacorus L. The effects ofgrowth regulators on regeneration from three explant sources (root, rhizome and leaf) were more or less same.Explants produced only callus with 2,4-D treatment and other regulators had no effects. The highest frequencyof callus induction (rhizome: 84%) was on MS media supplemented with 1.0 mg/L 2,4-D. For plantregeneration, when calli were transferred to the first media supplemented with 1.0 mg/L BA and 1.0 mg/L 2,4-D. Regenerated plants were successfully acclimatized in soil containing a mixture of vermiculite : perlite : leafmold(1 : 1 : 1), and their survival was high.

1. 서 론

붓꽃과(Iridaceae)식물은 다년생 숙근초로서 건조지나 습지에서 생육이 잘 되고 다양하고 화려한 화색으로 관상가치가 높은 장점을 지니고 있다. 붓꽃과는 전 세계적으로 80속 1,500종이 서식하는 것으로 알려져 있고, 적도남부지역에 50% 이상 분포하고 있다(Cronquist, 1981; Goldblatt, 1981).

우리나라에는 붓꽃속(Iris spp.) 17종과 계통학적으로 가까운 범부채속(Belamcanda spp.), 등심붓꽃속(Sisyrinchum spp.)의 2종을 포함하여 총 19종이 분포한다(Park. 2008). 그러나 최근에 이(2006)에 의한 분류로 애기범부채속을 포함하여 4속 총 31종이 서식하는 것으로 보고되었다. 이 중 노랑붓꽃(I. koreana), 노랑무늬붓꽃(I. odaesanensis), 대청부채(I. dichotoma)는 2005년 환경부 멸종위기 야생 동·시물 II급으로 지정 되어 보호받고 있고, 2012년에 노랑무늬붓꽃은 개체수가 많이 증가하여 멸종위기종 리스트에서 해제가 되었다. 또한 붓꽃속 중 노랑붓꽃(I. koreana), 노랑무늬붓꽃(I. odaesanensis), 흰각시붓꽃(I. rossii f. alba), 넓은잎각시붓꽃(I. rossii var latifolia)은 한국특산식물로 알려져 있다(Koh and Lee, 2003).

본 연구의 실험재료인 노랑꽃창포(Iris pseudacorus L.)는 붓꽃과(Iridaceae) 붓꽃속(Iris)의 다년생 정수식물로 유럽원산으로 오래 전에 우리나라에 귀화되어 우리나라 전역에 분포하고 있어 2006년부터 국가식물목록위원회 국가표준식물목록에서 자생종으로 분류되고 있다. 잎의 길이가 1 m 이상으로 생체량이 크고 다양한 환경 스트레스 조건에서도 적응력이 뛰어나며, 특히 꽃과 초형의 관상가치가 뛰어나 수생정원에 많이 이용되는 대표적인 자생식물이다(Lee, 2003).

최근 자원식물에 대한 관심이 높아지면서 이를 활용하고 보전할 수 있는 기초연구가 활발히 진행 되어 붓꽃과 식물을 이용한 다양한 연구가 보고되고 있다. 생태학적인 연구로는 Iris속 3종 및 도입종의 생육특성에 대한 연구(Koh, 2006), 노랑붓꽃과 금붓꽃의 입실시기 및 온도가 생장 및 개화에 미치는 영향에 대한 연구(Song, 2007), 생물소재 활용화 연구는 특이지방산의 탐색과 붓꽃과에서 중쇄지방산(myristic acid)의 확인을 통해 생물신소재로의 연구(Kim, 2001), 타래붓꽃종자 유래의 tocotrienol과 tocopherol함량에 관한 연구(Park, 2004) 등이 보고되고 있다. 이 외에도 붓꽃속 식물은 우리 생활에 바로 적용 가능한 것으로 자생수변식물의 수질정화능력에 대한 연구와 수위변동 비탈면의 녹화용 식물 선정을 위한 붓꽃속 식물의 침수기간에 따른 생육특성 연구로 생태적 복원과 수질개선의 효과를 얻을 수 있다는 보고도 있다(Park, 2008). 약용으로는 범부채의 말린 근경을 사간이라 하여 민간과 한방에서는 소염, 진통, 편도선염, 폐렴, 해열, 각기병, 치통 등에 약재로 처방했으며, 난장이붓꽃, 노랑무늬붓꽃, 부채붓꽃, 솔붓꽃, 타래붓꽃 등의 근경이나 종자를 약용으로 이용하고 있다(Ko, 1998). 한편, 도시공간을 아름답게하며 쉬운 재배조건으로 인해 재배 역사는 길지만 본격적인 개량은 19C 이후부터 이루어졌다. 일본에서는 야생의 꽃창포와 붓꽃을 관상용으로 이용하여왔고 야생종을 다양한 화훼 목적으로 개량하여 활용하고 있다. 일본붓꽃은 화려한 화색으로 인해 유럽 및 미국에서 이미 원예용으로 각광받고 있다. 

다양한 분야에서 활용할 수 있는 붓꽃과 식물은 지구온난화와 같은 환경변화와 오염, 인간의 무분별한 개발로 인해 자생지가 점점 줄어들고 훼손되어 점차 사라질 위험에 처해있다. 이를 방지하고 유전자원의 확보를 위해 자생지 복원과 자원식물에 대한 보호가 필요한 시점이다. 이를 위해 개체에 대한 생태적 특성을 연구하여 자생지 확보에 대한 노력이 필요하며 많은 개체 수 확보를 위해 빠른 번식방법에 대한 연구가 필요하다. 그러나 붓꽃과 식물의 일부 개체는 종자의 생산이 이뤄지지 않고 개화 이후 근경의 화경에서 1~2개의 새싹을 통한 분주번식과 종자번식에만 의존하여 개체 번식에 오랜 기간이 필요하다(Koh and Yoon, 2003). 

이를 해결하기 위한 방법으로 식물조직배양법이 이용이 되는데, 식물조직배양법은 대량 번식 방법으로 많이 활용되어지는 방법으로 보호종이나 멸종위기종의 대량증식에 이용되고 있다. 그 예로 새우난초(Chung et al., 1998; Bae et al., 2010), 풍란(Chung et al., 2004), 덩굴용담(Moon, 2009) 등이 있다.

붓꽃과 식물에 대한 기내 조직배양에 대한 연구는 MT배지를 이용한 범부채의 재분화(Kim et al., 1997), 꽃창포의 화기조직으로부터의 재분화(Koh and Yoon, 2003), 생장점을 이용한 붓꽃의 재분화(Koh, 2005)에 관한 연구뿐 국내자생 붓꽃과 30종에 비하면 극히 미비하고 생태적 자생지 복원 및 단기간의 번식, 우량 품종 육성을 위해선 대량증식에 관한 기초연구가 절실히 필요한 실정이다. 

따라서 본 연구에서는 수질정화식물 및 약용식물로 각광을 받고 있는 자생식물인 노랑꽃창포의 기내 식물체 생산에 미치는 식물생장조절물질 영향에 대해 조사하고, 재분화 조건을 탐색하여 지속가능한 생태계 유지식물의 보전 및 관련 종의 자생지외 복원 시원종공급 등의 기초자료 및 소재를 제공하고자 연구를 수행하였다.

2. 연구 방법

2.1. 식물재료 및 배양환경

실험에 사용한 노랑꽃창포(Iris pseudoacorus L.)는 경기도 용인에서 2008년 5월에 종자 7립을 채집하였다(Figure 1). 종자는 종피를 제거 한 후 멸균된 증류수에 1시간 침지시킨 다음 70% EtOH에 1분간 표면 살균 한 후 3% sodium hypochlorite용액에 20분간 침지하였다. 그리고 멸균된 종자를 멸균된 증류수로 5회 이상 수세한 후 마지막 단계에서 5분간 침지하여 sodium hypochlorite용액을 완전히 제거한 후, 멸균된 filter-paper 위에 올려놓아 물기를 제거하였다. 발아 배지는 1/3MS(Murashige and Skoog, 1962)에 30 g/L sucrose와 3.0 g/L gelrite를 첨가한 배지를 사용하였다. 모든 배양은 온도 22 ± 1oC, 광주기 16/8시간, 광도 46 μmol m−2s−1의 배양실에서 배양하였고, 실험에 사용한 모든 배지와 기구는 121oC, 1.5기압으로 20분간 고온·고압 멸균하여 페트리디쉬는 30 ml, 4각 plastic 배양병(SPL, Korea)에 각각 100 ml씩 배지를 분주하여 실험에 사용하였다.

Figure 1. The native Iris preudoacorus L. was collected from the fields in Yongin.

2.1. 노랑꽃창포의 캘러스유도

노랑꽃창포의 종자발아체로부터 캘러스를 유도하기 위해 3종의 뿌리, 근경, 잎을 각각 1 × 1 cm로 절단하였다. 절단된 노랑꽃창포의 뿌리, 근경, 잎 부위는 0,0.5, 1.0, 3.0 mg/L 2.4-D(2,4-Dichlorophenoxy acetic acid), NAA(Naphthalene acetic acid), IAA(Indole acetic acid)를 각각 단용 처리한 MS배지와 1 mg/L 2.4-D와 0.1, 1.0 mg/L BA 혼용 처리한 MS배지에 치상하여 4주후 캘러스유도율과 크기를 조사하였다.

2.2. 신초증식에 미치는 식물생장조절물질의 영향

노랑꽃창포 캘러스 유래로부터 신초형성에 미치는 요인을 확인하기 위해 뿌리, 근경, 잎 부위에서 유래된 캘러스를 모조직으로부터 분리하여 1.0 mg/L의 2.4-D와 1.0 mg/L의 BA가 혼용 처리된 MS배지에 치상하여 4주간 배양한 다음 신초유도율과 신초길이를 조사하였다.

2.3. 발근 및 토양순화

기내뿌리유도를 통한 효과적인 식물체 생장 및 순화를 위해 신초의 길이가 초장이 5~8 cm로 신장된 유식물체를 분리하였다. 분리된 유식물체는 1/2MS배지에 30 g/L의 sucrose를 첨가하고 0, 0.1, 1.0, 및 3.0 mg/L의 IBA 또는 NAA를 단용 처리한 배지위에 치상하였다. 실험에 사용한 개체는 5개체씩 3반복하였으며 6주후에 발달된 뿌리의 수와 길이를 각각 조사하였다. 초장 6~10, 근장 3 cm로 정상적으로 뿌리와 줄기가 발달한 식물체를 토양에 이식하여 생존율을 확인하였다. 

2.4. 통계분석

모든 데이터는 means ± standard deviation으로 표시하였다. 변인들의 집단간 차이를 알아보기 위해서 one-way ANOVA를 실시하였고, 유의성이 있는 경우 Duncan's multiple range test로 사후검증을 하였다. 통계적 유의성은 P < 0.05로 설정하여 분석하였다.

3. 결 과

3.1. 배양부위에 따른 노랑꽃창포의 캘러스유도

기내 조직배양을 통한 재분화 시스템의 확립은 초기 배양재료의 선택이 중요하다. 노랑꽃창포 역시 효과적인 재분화 시스템을 확립하기 위해 뿌리, 근경, 잎부위 및 옥신종류 및 농도에 따른 캘러스 유도율을 조사하였다. 캘러스유도 조건을 조사하기 위해 종자에서 발아된 유식물의 잎, 근경, 뿌리를 절단하여 IAA, NAA, 2,4-D홀몬이 첨가된 배지에서 4주간 배양한 결과, NAA, IAA를 첨가한 배지에서는 노랑꽃창포의 잎, 뿌리, 근경절편 모두에서 control(Figure2A)과 같이 변화가 없었고, 2,4-D를 첨가한 배지에서는 배양 2주부터 절단면이 부풀어 오르기 시작하였고, 3주가 지나면서 잎(Figure 2B), 근경(Figure 2C), 뿌리(Figure 2D)에서 모두 노란색의 캘러스가 형성되기 시작했다. 4주까지 캘러스의 증식을 확인하였다. 캘러스의 유도와 증식은 2,4-D가 첨가가 되면 잎, 근경, 뿌리부위 모두에서 일어났지만 근경과 뿌리부위는 잎 부위보다 캘러스 유도율이 6 배 이상 높았고 크기도 2~4 배 이상 큼을 확인하였다(Table 1). 이와 같이 배지에 첨가하는 생장조절물질과 배양부위는 재분화 시스템 확립의 완성도를 높이는데 많은 영향을미치는 것으로 사료된다. 참돌꽃(Rhodiola rosea L.)의 경우, 잎절편을 치상하여 BA와 NAA가 복합적으로 처리가 되었을 때 부정아 및 캘러스 유도율이 가장 우수하다는 결과를 보고하였고(Bae et al., 2005), 또한 난과 식물인 새우난초(Calanthe discolor)의 조직배양을 통한 식물체 생산에서도 새우난초의 배양부위(잎, 구경, 뿌리)에 따라 부정아유도율과 캘러스 유도율이 다르고 식물체 재생율에 많은 영향을 주는 것으로 보고되었다(Bae et al., 2010). 이와 같이 배양부위 및 배지에 첨가하는 생장조절물질의 종류와 농도에 따라 캘러스 유도 및 신초분화 양상이 다르게 나타남을 알 수 있다(Ryu et al., 1992). 신초의 분화 및 생장에는 세포의 생장과 분열을 촉진하는 생장조절물질(옥신과 사이토키닌)의 첨가가 필수적이며, 배양부위의 분열부위 존재 유무 등이 초기 배양의 성패를 좌우하는 중요한 인자로 작용하는 것으로 보여진다.

Figure 2. Induction of callus of explnats from Iris pseudoacorus. (A) Control, (B) Leaf on 1.0 mg/L 2,4-D, (C) Rhizome on 1.0 mg/L 2,4-D, (D) Root on 1.0 mg/L 2,4-D in MS medium after 4 weeks of culture, Scale bar = 1 mm.

Table 1. Effect of plant growth regulators (auxins) on callus formation from leaf, rhizome and root of Iris pseudoacorus after 4 weeks.

3.2. 노랑꽃창포의 신초발달에 미치는 식물생장조절 물질의 영향

노랑꽃창포의 재분화체를 생산하기 위해 자엽, 근경, 뿌리로부터 4주간 유도 증식한 캘러스를 2,4-D와 BA를 단독 또는 혼합 처리한 MS배지에 치상하여 신초유도율을 조사하였다. 유도된 캘러스를 생장조절물질이 첨가 되지 않은 MS배지에 배양하였을 때는 더 이상의 캘러스 생장이나 유도가 이루어지지 않았으며, 부정근이 유도됨을 일부 관찰하였다. 또한 자엽, 근경(Figure 3A), 뿌리유래 캘러스는 1.0 mg/L 2,4-D 단용과 1.0 mg/L BA 혼용 처리시 모두 분화가 이루어 졌는데 2,4-D 단용처리보다 BA를 혼용 처리하였을 때 20% 높은 분화율을 확인 할 수 있었다(Table 2). BA가 혼용 처리되면 캘러스는 2주 후부터 초록색으로 캘러스가 변화되며 shoot primordia로 전환되는 것을 확인하였고 초록색으로 변화된 캘러스는 종자발아체의 자엽과 비슷한 형상을 지니며 분화되기 시작하였다(Figure 3C). 분화가 시작된 캘러스는 약 6~7주 후에 잎이 3 cm 이상 분화하여 식물체의 모습으로 변화하였다(Figure 3D). 하지만 2,4-D를 단용처리한 실험구는 시간이 지나면서 shoot primordia가 형성은 되지만 엽록소가 침적이 되지 않음을 확인하였고(Figure 3B), 엽록소가 침적이 되지 않으면 4주 후 고사됨을 알 수 있었다. 많은 붓꽃과 식물의 재분화에 있어서 사이토키닌류인 BA가 부정아의 유도 및 분화에 가장 효과적인 생장조절물질로 보고되고 있고(Hussey 1976; Meyer and van Staden 1998; Shibli and Ajlouni 2000; Koh 2005; Madubanya et al., 2006), 본 연구결과와 동일한 연구결과를 보여주고있다. 본 연구결과는 다양한 식물생장조절물질을 단용 또는 혼용처리하지는 않았지만 초기 배양부위 유래 캘러스의 계속적인 활용으로 뿌리유래 캘러스가 식물체의 분화에도 좋은 효과를 지니는 것으로 확인 하였다(Table 2).

Figure 3. Plant regeneration from callus derived rhizome of Iris pseudoacorus. (A) Callus derived rhizome, scale bar = 4mm, (B) Development of shoot primordia on MS medium supplemented 1.0 mg/L 2,4-D after 4 weeks of culture, scale bar = 3 mm, (C) Development of shoot primordia on MS medium supplemented 1.0 mg/L 2,4-D with 1.0 mg/L BA after 4weeks of culture, scale bar = 2 mm, scale bar = 3 mm, (D) Shoot elongation of developed shoot, scale bar = 3 cm, (E) Acclimatized plantlet in soil, arrow was flower, scale bar = 10 cm, (F) Seeds of I. pseudoacorus after 4 months of culture in soil, arrows are seed, scale bar = 5 mm.

Table 2. Effect of plant growth regulators (auxins) on callus formation from leaf, rhizome and root of Iris pseudoacorus after 4 weeks.

3.3. 노랑꽃창포의 기내발근 및 토양순화

신초의 증식과정을 통해 얻어진 유식물체의 효율적인 생장과 뿌리발달을 이루기 위해 발근에 적합한 배지를 조사하였다. 1/2MS 배지에 IBA 또는 NAA를 단용 처리하여 4주간 배양한 결과, 유도된 뿌리의 길이는 1.0 mg/L의 IBA가 첨가된 배지에서 8.4 cm로 가장 높았고 옥신을 처리하지 않은 대조구에서는 발근이 이루어지지 않았다(Table 3). 본 실험에 사용한 노랑꽃창포의 경우 초기(배양 4주) 발근율이 다른 식물에 비해 현저히 낮았다. Chung 등(2004)은 심비디움의 생장점 배양을 통한 다신초 유도시 옥신을 처리할 경우 발근율이 50% 증가한다는 보고를 하였다. 그러나 Malabadi 등(2004)은 Vanda coerulea에서, Emst(1994)는 Doritaenopsis와 Phalaenopsis에서 식물생장조절제의 농도가 높은 배지에서 생장, 분화된 신초일수록 발근율이 감소한다고 하였다. 일반적으로 기내배양체(초본, 목본류)의 발근은 토양순화 시 토양활착을 양호하게 하기 위한 전단계로 정상적인 기내발근이 이루어져야 토양순화 후 배양체가 생존할 확률이 높아지는 것이다. 하지만 내생옥신 (endogenous auxin)이 많은 식물의 경우 식물생장조절물질이 첨가되지 않은 배지에서도 발근이 잘 이루어지는 것으로 알려져 있다. 특히 목본류인 개느삼(Echinosophora koreansis)과 팔손이(Fatsia japonica), 초본류인 고추나물(Hypericum erectum)의 경우 옥신류 식물생장조절물질 무첨가 배지에서도 20~50% 이상의 발근률을 보였다(Choi et al., 2005; Kim et al., 2006; Moon and Kim, 2008). 이는 수종은 다르지만 우선 노랑꽃창포는 내생옥신이 다른 식물에 비해 적음을 유추할수 있는 결과로 사료된다. 기내배양 식물의 효율적인 토양순화는 실용화(산업화)의 측면에서 매우 중요한 요인이다. 유용한 성분을 함유하고 있는 식물과 희귀 및 멸종위기종의 경우 특히 더 중요하다. 노랑꽃창포의 기내 발근(Figure 3D) 후 4주후에 순차적 순화를 통해 토양에 이식한 결과 100%의 생존율을 확인 할 수 있었고 이식한 해 8월에 꽃이 핌을 확인하였다(Figure 3E). 또한 낙화이후 열매결실을 확인하였는데 (Figure 3F) 이는 재분화체의 F2세대를 확인하는데 중요한 요인으로 작용한다고 생각된다. 따라서 본 결과에서 노랑꽃창포 유식물체를 이용하여 각각의 부위(잎, 구경, 뿌리) 및 옥신종류 및 농도에 따른 최적의 캘러스 유도조건을 조사하였고, 유도된 캘러스를 이용하여 분화에 최적인 사이토키닌 농도를 확인하였다. IBA와 NAA의 농도에 따른 발근율을 조사하여 성공적인 기내배양을 통한 재분화 시스템을 확립하였다.또한 기외순화를 통한 재분화체의 서식지외 보존을 할 수 있는 연구결과를 도출하였다. 이러한 결과는 향후 노랑꽃창포의 형질전환을 통한 품종개량이나 유용한 유전자를 통한 형질전환 식물체의 개발에 중요한 기초자료를 제공할 것으로 생각된다.

Table 3. Effect of IBA and NAA concentration on root induction from plantlet of I. pseudoacorus after 6 weeks of culture.

4. 결 론

자생식물인 노랑꽃창포의 재분화에 미치는 식물생장조절물질의 영향에 관해 연구 하였다. 캘러스 유도에 미치는 식물생장조절물질을 확인하기 위해 2.4-D, NAA, IAA 각각 농도별로 처리한 단용배지에서 노랑꽃창포의 잎, 근경, 뿌리를 배양하였다. 2,4-D가 처리된 배지에서는 잎, 근경, 뿌리 모두에서 캘러스가 유도되었고, NAA와 IAA가 첨가된 배지에서는 잎, 근경, 뿌리 모두에서 캘러스 형성이 이루어지 않았다. 캘러스유래로부터 식물체의 재분화 조건은 1.0 mg/L 2,4-D와 1.0 mg/L BA가 혼합 처리된 실험구에 뿌리유래 캘러스를 배양하였을 때 98%의 높은 신초 분화율을 확인하였다. 신초발달 이후 뿌리발달을 통한 건전식물체 생산은 토양순화의 전단계에서 중요한 요인으로 작용하는데 이를 성공적으로 수행하기 위해IBA와 NAA의 농도에 따른 발근율을 조사하였다. 발근은 대조구에 비해 IBA와 NAA처리구는 모두 성공적으로 이루어 졌고, 1.0 mg/L IBA를 처리하였을 때 절편당 16개, 근당 8.4 cm의 높은 발근양상을 확인하였다. 발근이후 토양순화는 80개의 순화개체가 모두 4주간 생존하였고 18주후에 꽃이 핌을 확인하였다.

결과적으로 본 연구는 노랑꽃창포의 재분화체 생산시 배양부위, 식물생장조절제의 영향등에 관해 구체적인 결과를 제시하였고, 이러한 결과는 특산식물 또는 멸종위기 식물의 보전 및 생산에도 중요한 기초자료로 제공될 것으로 사료된다.

87-93 02_배기화.pdf373.5KB

Reference

1.이영노. 2006. 새로운한국식물도감, 교학사.
2.Bae, K. H., Yoon, E. S., Yun, P. Y., and Choi, Y. E. 2010. Soil acclimatization of Calanthe discolor throught multiple shoot formation from tissue culture, Kor. J. Plant Res. 23(1): 7-13.
3.Bae, K. H., Yoo, J. A., and Yoon, E. S. 2005. Effect of growth regulators of plant regeneration from Rhodiola sachalinensis leaf segments, Kor. J. Plant Res. 18: 410-416.
4.Choi, K. M., Hwang, S. J., Ahn, J. C., Lee, H. Y., Kim, J. H., and Hwang, B. 2005. In vitro propagation from axillary bud explant of Fatsia japonica Deene. et Planch, Kor. J. Med. Crop Sci. 13: 300-303.
5.Chung, J. D., Chung, M. Y., and Jee, S. O. 1998. Effect of culture media on asymbiotic seed germination and those seedling growth of Calanthe discolor and Habenaria radiata, Kor. J. Plant Biotechnol. 25: 189-194.
6.Chung, J. D., Seo, J. H., Jee, S. O., and Kim, C. K. 2004. Effect of medium composition on multiple shooting andsubsequent growth of mericlone from rhizome of shoottip culture of temperate Cymbidium species, J. Kor. Hort. Sci. 39: 343-349.
7.Cronquist, A. 1981. An Integrated System of Classification of Flowering Plants, Columbia Univ. Press. New York. 1211-1213.
8.Goldblatt, P. 1981. Systematics, Phylogeny and evolution of Dietes (Iridaceae), Ann. Missou. Bot. Garden 68: 132-153.
9.Emst, R. 1994. Effects of thidiazuron on in vitro propagation of Phalaenopsis and Doritaenopsis (Orchidaceae), Plant Cell Tiss. Org. Cult. 39: 273-275.
10.Hussey, G. 1976. In vitro release of axillary shoots from apical dominance in monocotyledonous plantlets, Ann. Bot. 40: 1323-1325.
11.Kim, M. L., Nam, D. W., Ahn, J. C., and Hwang, B. 2006. Micropropagation of Hypericum erectum by axillary bud culture, Kor. J Med. Crop. Sci. 14: 23-26.
12.Kim, H. S., and Song, W. S. 1997. Effect of plant growth regulators and medium salt strength on in vitro propagation of Belamcanda chinensis DC, J. Kor. Plant Res. 10(2): 114-121.
13.Kim, J. B. 2001. The composition of useful medium chain fatty acids in eight plant species, J. Kor. Soc. Agric. Chem. Biotechnol. 44(1): 20-23.
14.Ko, S. G. 1998. Gamaily Araceae, Amaryllidaceae, iridaceae. Korea research institute of bioscience and biotechnology, Plant of Korea Vascular Plants 1: 157-260.
15.Koh, J. C., and Lee, J. M. 2003. Effect of colchicine on chromosome doubling in Iris spp, J. Kor. Soc. Hort. Sci. 44(2): 245-250.
16.Koh, J. C. and Yoon, I. K. 2003. Effects of light, temperature, and sucrose on plant regeneration from the flower organ explant in Iris ensata, J. Kor. Plant Biotechnol. 30(1): 41-45.
17.Koh, J. C. 2005. Callus culture and plant regeneration from shoot apex of Iris Sanguinea Donn ex. Horn. J. Plant Biotechnol. 31(1): 19-23.
18.Koh, J. C. 2006. Growth characteristics of native and introduced Iris Species. Flower Res. J. 14(4): 300-305.
19.Lee, T. B. 2003. Coloured flora of Korea. Hyangmunsa, Seoul, Korea.
20.Madubanya, L. A., Makunga, N. P., and Fennell, C. W. 2006. Dierama luteoalbidum : liquid culture provides an efficient system for the ex situ conservation of an endangered and horticulturally valuable plant, S. Afr. J. Bot. 72: 584-588.
21.Malabadi, R. B., Mulgund, G. S., and Nataraja, K. 2004. Efficient regeneration of Vanda coerulea, an endangered orchid using thiadiazuron, Plant Cell Tiss. Org. Cult. 76: 289-293.
22.Meyer, H. J. and J. van Staden. 1998. in vitro multiplication of Ixia fkexuosa, Hort. Sci. 23: 1070-1071.
23.Moon, H. K. 2009. Effect of plant growth regulators on micropropagation of a rare and endangered species, Tsuru-rindo (Tripterospermum japonicum), J. Plant Biotechnol. 36(1): 13-17.
24.Moon, H. K. and Kim, Y. W. 2008. In vitro propagation of a rare species, Echinosophora koreensis Nakai. by axillary bud culture, Kor. J. Plant Tiss. Cult. 35: 229-234.
25.Murashige, T. and Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures, Physiol. Plant. 15: 473-479.
26.Park, K. Y. 2004. Tocotrienol and tocopherol content in various plant seeds, Kor. J. Crop Sci. 49(3): 207-210.
27.Park, C. M. 2008. Growth characteristics of 4 Iris Species by flooding periods for revegetation plants selection in water level changing slopes, Kor. J. Env. Eco. 22(6): 640-647.
28.Ryu, J. H., Doo, H. S., and Kwon, T. H. 1992. Induction of haploid plants by anther culture in sesame (Sesaum indicum L.). Kor. J. Plant Biotech. 19: 171-177.
29.Song, C. Y. 2007. Effect of forcing date and temperature on growth and flowering of Iris koreana and Iris minutoaurea. J Korean For. Soc. 96(6): 699-704.
30.Shibli, R. A. and Ajlouni, M. M. 2000. Somatic embryogenesis in the endermic Black Iris. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 61: 15-21.