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ISSN : 1976-6769(Print)
ISSN : 2287-8122(Online)
Korean Journal of Nature Conservation Vol.6 No.1 pp.49-53
DOI :

16S rDNA 분석에 의한 잔디생초에 분포하는 셀룰로스 분해세균의 동정

조성준1, 이용성2, 김상준3, 김길용2, 정병곤4, 노희명5, 이건형1*
1군산대학교 자연과학대학 생물학과
2전남대학교 농업생명대학 생명화학과
3자연과 사람 주식회사
4군산대학교 공과대학 환경공학과
5서울대학교 농업생명과학대학 응용생명화학

Identification of Cellulolytic Bacteria from the Grasses by 16S rDNA Analysis

Geon-Hyoung Lee1*, Sung-Jun Cho1, Yong-Seong Lee2, Sang-Jun Kim3, Kil-yong Kim2, Byoung-Kon Jeong4, Hee-Myong Ro5
1Department of Biology, College of Natural Sciences, Kunsan National University
2Department of Biological Chemistry, College of Agriculture and Life Science,
3Corporation of Nature and People,
4Department of Environmental Engineering,
5Department of Applied Biology and Chemistry, College of Agriculture and Life Sciences, Seoul National University
(Received 12 April 2012; Revised 30 May 2012; Accepted 14 June 2012)

Abstract

Population densities of aerobic heterotrophic bacteria by plate counting method were in the range of 3.5 ± 0.2× 106~1.8 ± 0.7 × 107 cfu g-1 dry wt. from the grasses of Gunsan Country Club which sampled from August toOctober, 2011. We selected the celluloytic bacteria from aerobic heterotrophic bacteria and identified 6 strainsamong ninety-six isolates by using 16S rDNA analysis. As a result, four isolates belonged to Firmicute group,two isolates belonged to Gamma-proteobacteria group and Actinobacteria group, respectively. We also analysedthe cabon sources utilization patterns of six isolates. D-cellobiose, D-Fructose, D-Galactose, D-Mannose, DMelibiose,D-Psicose, Gentiobiose, Lactulose, L-Arabinose, L-Fucose, Turanose, α-D-Glucose, and α-D-lactoseamong 95 carbon sources are utilized by all six isolates.

49-53 이건형.pdf466.2KB

1. 서 론

골프장에서 발생하는 잔디예초물은 퇴비의 원료로써 가치가 높음에도 불구하고 폐기물관리법시행령에 일일 300 kg 이상 발생하는 폐기물은 사업폐기물로 분류되어 있다. 한 개의 골프장에서 발생하는 잔디예초물과 같은 유기성 폐기물은 대략 1600 m3  정도이며, 우리나라 전체에서 발생하는 연간 잔디예초물 처리비용은 골프장 유지비용에 상당부분을 차지한다(함, 2005). 골프장의 잔디는 항상 초록빛을 유지해야하므로 수목용 농약을 살포하며(농약공업협회, 2004). 이로 인해 지하수 오염 및 병충해 발생 등이 증가되는 문제를 야기될 수 있다. 또한 수거된 잔디는 몇 개월간 부숙기간을 거쳐 농업용으로 사용될 수 있으나 잔류농약 문제로 유기농 농가에서는 사용할 수 없다. 따라서 농약을 사용하지 않는 친환경적인 잔디예초물 분해를 위해서는 잔디의 성분 중 높은 비율을 차지하는 섬유소를 분해하는 미생물의 개발이 무엇보다도 우선적이다. 따라서 본 연구에서는 잔디예초물을 분해시키는 데 기여할 수 있는 cellulose 분해 균주를 탐색·분리하고, 16Sr DNA 분석법을 이용하여 우수 섬유소 분해 균주를 동정하였으며 그 특성을 조사하였다.

2. 재료 및 방법

2.1. 호기성 종속영양세균의 균체수 측정

 군산 Country Club(CC) 내 잔디예초물에 존재하는 호기성 종속영양세균의 측정을 위하여 2011년 8월과 10월 중 토양 2곳과 잔디예초물 2곳을 선정하여 2회에 걸쳐 시료를 채취하였다. 채취된 시료는 4℃를 유지하여 실험실로 운반한 후 멸균된 생리식염수 (0.85% NaCl)로 희석하였다. 희석된 시료는 200 rpm으로 30분간 진탕하여 Nutrient (NA)(Difco, USA) plate에 100 μl을 도말한 다음 28±2℃에서 5일간 배양하여 나타난 균체수를 계수하였다. 이 때 미생물 측정 단위는 colony-forming units(cfu)g-1  dried weight(d. wt.)로 환산하였다(박과 이, 2006).

2.2. Cellulose 분해 세균의 분리

 토양 및 잔디예초물에 존재하는 cellulose 분해 세균을 분리하기 위해 현장에서 채취한 시료를 실험실로 옮긴 후 멸균된 생리식염수(0.85% NaCl)로 희석하여 유일한 탄소원으로 Carboxymethylcellulose(CMC) (Sigma, USA)가 첨가된 배지(CMC-Sodium salt 5g, NaNO3  2g, K2 HPO4  1g, MgSO4 0.5g, KCL 0.5g, Peptone 0.2g, Agar 18g Distilled water 1 L)에 도말하여 28 ± 2℃에서 3~5일간 배양한 후, 생성된 콜로니를 순수분리 하였다.

2.3. Cellulose 분해능 측정

 선발된 우수 균주들의 Cellulase 활성은 CMC를 기질로 하여 효소 반응을 수행한 후, 유리된 생성된 환원당을 DNS(3,5-dinitrosalicylic acid)법에 의해 측정하였다(Miller, 1959). 순수 분리된 single colony들은 CMC 배지에서 20시간 배양하여 원심분리한 후, 상등액을 분리하여 실험에 이용하였다. 그 후, 분리된 상등액 50 μl, DNS solution(NaOH 1.398g, phenol 0.537 ml, Na2 S2 O5  0.585g, potassium sodium tartrate 21.61g, 3,5-dinitrosalicylic acid 0.748g, DW 100 ml) 100 μl, citrate buffer 50 μl 혼합하여 5분 동안 물중탕 한 후, 바로 아이스에서 반응을 중지시켜 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이를 동일조건 하에서 측정된 glucose를 표준시료로 사용하여 동일 조건하에서 발색시켜 조사한 흡광도와 비교함으로써 유리된 환원당의 양을 결정하였다. 효소활성은 분당 1 μmole의 glucose를 생성한 것을 1 unit으로 정의하였다(허등, 2005).

2.4. 엽록체 DNA 분리 및 증폭

 군산 CC 내 토양 및 잔디예초물에서 순수 분리된 cellulose 분해세균을 NA 및 LB broth(Difco, USA)에서 18~24시간 동안 진탕 배양하여 집균한 균액 100μl를 lysis buffer(5.25 M guanidinium thiocyanate, 50mM Tris-HCl[pH 6.4], 20 mM EDTA, 1.3%[wt/vol] Triton X-100) 200 μl, Lysozyme 1 μl(100 mg/ μl)와 골고루 섞어 30℃에서 30분간 반응시킨 후에 Proteinase K 1 μl(20 mg/ μl)를 첨가한 후 56℃에서 30분간 반응시킨다(Schuurman et al., 2004). 반응 후, Multiscreentm  HTS Glass Filter(Millipore. USA)에 옮겨 vacuum manifold(Millipore. USA)를 이용하여 DNA를 glass filter에 결합시킨 후 70% Ethanol 200 μl를 넣어 glass filter를 2회 세척하고 TE solution(10 mM Tris-HCl[pH 8.0], 0.1 mM EDTA) 50 μl를 넣어 DNA를 elution하여 다음 실험 시까지 −20℃에서 보관하였다. 그 후 세균의 16S rDNA를 증폭하기 위하여 universal primer인 27F와 1492R을 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 10X PCR buffer(50 mM KCl, 0.01% gelatin, 10 mM Tris-HCl, pH 9.0) 5 μl, 250 mM MgCl2  4 μl, 10 mM dNTP 1 μl, 10 pmol primer 5 μl, 그리고 1 Unit의 Taq polymerase(TaKaRa, Japan)를 넣은 후, 여기에 20 ng의 template DNA를 첨가하고 ddH2 O로 최종 반응량을 50 μl로 맞추었다. PCR 증폭은 thermal cycler GenAmp PCR system 9700(Applied Biosystems, USA)를 사용하여 수행하였다. PCR 증폭과정은 predenaturation 과정으로 94℃에서 10분간 수행하였고, 94℃에서 30초간 denaturation, 55℃에서 30초간 primer annealing, 72℃에서 75초 extension을 총 30회 반복하고, 72℃에서 7분간 최종 반응시켰다. 증폭된 PCR 산물은 0.7% agarose gel(SeaKem® LE, TaKaRa)에서 전기영동 한 후 ethidium bromide(0.5 μg ml-1 ) 용액에 5분간 염색한 후 UV 분광광도계Gel Doc XR system(Bio-Rad, USA)를 이용하여 260nm 파장에서 약 1.5 kb에 해당하는 DNA하여 UV 조사장치로 약 1.5 kb에 해당하는 DNA 밴드를 확인하였다.

2.5. 16S rDNA 염기서열 분석 및 계통분류학적 분석

 16S rDNA 염기서열을 분석하기 위해 증폭된 PCR산물을 0.7% agarose gel에서 전기영동한 후, 서열분석을 하기 위해 1.5 kb에 해당하는 밴드를 확인하여 절단한 후 Gel extraction kit(Bioneer, Korea)를 이용하여 정제하였다.

 Gel로부터 정제된 DNA는 유전자 서열 분석은 miDNA 유전체 연구소(Korea)에 의뢰하여 분석하였다. 유전자 서열 분석을 위한 primer로는 27F, 1492R을 이용하여 양쪽 방향 모두 염기서열 해독을 실시하였다. 세균들의 16S rDNA의 부분 염기서열을 Blast network service를 이용하여 EMBL/GenBank database의 염기서열을 비교하여 속명을 확정하였다 (Altschul et al., 1997). 그 후 MEGA program을 이용하여 표준균주와의 계통분류학적 유연관계를 분석하였다(Koichiro et al., 2007).

2.6. 탄소원 이용 패턴 측정

 BIOLOG Microplate를 이용한 탄소원의 측정방법은 우선 순수 분리된 균주를 Tryptic soy agar(TSA) (Difco, USA) 배지에 접종하여 37℃에서 24~48시간 배양 후, oxidase test를 통하여 GN-NENT와 GN-ENT로 구별하였다. 각 균주를 BUG+B Biolog Universal Growth Media+ sheep blood)에 접종하여 GN-NENT 균주는 항온기에서 35~37℃로 24시간 배양하였다. BUG+B에 배양된 균주는 접종액(0.4% sodium chloride, 0.03% pluronic F-68, 0.01% gellan gum)에 접종하여 vortex로 진탕시켰다. 이때 탁도는 BIOLOG turbidometer(Model 21906)로 GN-NENT는 52%, GN-ENT 는 63%로 맞추되 GN-ENT의 경우 접종용액의 포자의 형성을 막기 위해 thioglycolate 용액을 3방울 첨가하였다. 다음 단계로 BIOLOG GN2 microplate에 혼탁된 균주를 150 μl씩 분주하여 GN-NENT는 30℃에서 GN-ENT는 35~37℃에서 각각 4~6시간, 16~24시간 배양한 후 BIOLOG identification system(BIOLOG, USA)을 이용하여 탄수화물의 이용여부를 측정하였다(배, 2003).

3. 결과 및 고찰

3.1. 종속영양세균의 분포

 2011년 8월과 10월의 군산 Country Club(CC)의 토양 및 잔디예초물에 분포하는 종속영양세균을 도말평판법으로 측정한 결과, 2011년 8월에서는 3.5 ± 0.2 ×106  cfu g-1 d.wt.를 나타났으며, 10월에는 1.8 ± 0.7 ×107  cfu g-1 d.wt.로 나타나 2011년 10월의 균체수가 2011년 8월에 측정된 균체수보다 약 5배 정도 높게 나타났다. 이는 2011년 8월의 여름 집중호우의 영향과 관계가 있는 것으로 사료된다.

3.2. 섬유소분해세균의 분리 및 분해능 측정

 선발된 cellulose 분해균주들의 Cellulase 활성을 측정결과, Table 1에서 보는 바와 같이, 6개의 균주 중Pseudomonas luorescens가 가장 높은 활성도를 보였고, 그 다음으로 Streptomyces griseus가 높은 활성도를 보였다.

Table.1. Cellulase activities of six isolates from the soil of Gunsan Country Club

3.3. 16S rDNA 염기서열 분석 및 계통분류학적 분석

 조사기간 중 분리된 6균주를 계통분류학적으로 분석한 결과, Low G+C Gram-positive bacteria 그룹으로 알려진 Firmicute 그룹에 속하는 4균주와 생리적 특성이 다양한 화학유기영양생물 그룹으로 알려진 Gamma-Proteobacteria 그룹, high G+C Gram-positive bacteria 그룹인 Actinobacteria 그룹에 속하는 균주가 각각 동정되었다(Table 1). Bacillus circulans(kc13), Bacillus licheniformis(kc82), Bacillus mycoides(kc21)은 물, 공기, 토양 및 수질환경 등 여러 환경에서 발견되며, 각종 체외효소, 항생물질, 아미노산, 핵산, 비타민 등의 유용물질을 생산하며 유전공학 실험시 위험성이 적어 널리 이용되는 Bacillus 속에 속하는 것으로 나타났다(이, 1985). 그 중 kc13은 곰팡이 및 효모 세포벽의 주요 구성분이며 해양 거대조류의 구조, 저장 다당체(laminarin)의 β-1,3-glucosidic linkage의 가수분해촉매 효소를 생산하는 Bacillus circulans와 염기서열 유사도 값이 98%로 높게 나타났다(고, 2003). 그리고 kc82는 cellulase 및 amylase를 생산하는 균으로 알려져 있는 Bacillus licheniformis 와 염기서열 유사도 값이 99%로 높게 나타났다(우와 김, 2007). 또한 kc69는 펙틴, 리그닌, 키틴, 케라틴 등의 방향복합물질을 분해하며, 다양한 종류의 항생제를 합성하는 능력으로 잘 알려진 Streptomyces에 속하는 Streptomyces griseus로 동정되었다. kc31은 여러 온도 및 pH의 환경에서도 안정한 항생물질을 분비하는 Paenibacillus ehimensis와 유사도 값이 99%로 높게 나타났다(조, 2002).

 마지막으로 kc84은 Rhizoctonia solani, Pythium ultimum, Fusarium oxysporum 등 여러 가지 작물의 모잘록병을 방제하는 항·진균물질을 분비하는 종으로 알려진 Pseudomonas fluorescens와 유사도 값이 99%로 높게 나타났다(김 등, 1998).

3.4. 탄소원 이용의 측정 및 동정

 BIOLOG에 의한 탄소원 이용을 측정한 결과, 선발된 6균주들이 모두 이용하는 기질로는 D-cellobiose, D-Fructose, D-Galactose, D-Mannose, D-Melibiose, DPsicose, Gentiobiose, Lactulose, L-Arabinose, L-Fucose, Turanose, α-D-Glucose, α-D-lactose로 나타났다. 반면 6균주들이 모두 이용하지 않는 기질로는 2,3-Butanediol, 2,3-Butanediol, Acetic Acid, Adenosine, Adenosine-5-Monophosphate, Amygdalin, Arbutin, D-Alanine, D-Arabitol, D-Gluconic Acid, D-Lactic Acid Methy Ester, D-L-α-Glycerol, Phosphate, D-Malic Acid, DMannitol, D-Melezitose, D-Raffinose, D-Sorbitol, DTrehalose, Glycerol, Glycogen, Glycyl-L-Glutamic Acid, Inosine, Inulin, Lactamide, L-Alaninamide, L-Alanine, L-Alanyl-Glycine, L-Asparagine, L-Glutamic Acid, LLactic Acid, L-Malic Acid, L-Pyroglutamic Acid, LSerine, Mannan, m-Incositol, N-Acetyl-L-Glutamic Acid, p-Hydroxy-Phenylacetic Acid, Propionic Acid, Putre-Figure 1. A phylogenetic tree showing the affiliation of 16S rDNA sequences to selected reference sequence of the heterotrophic bacteria in the soil at Gunsan Country Club. The tree was constructed from a distance matrix by the neighbourjoining analysis. The scine, Pyruvic Acid, Pyruvic Acid Methyl Ester, Salicin, Sedoheptulosan, Stachyose, Succinamic Acid, Succinic Acid, Succinic Acid, Mono-Methyl Ester, Surose, Thymidine, Thymidine-5-Monophosphate, Tween 40, Tween80, Uridine, Uridine-5-Monophosphate, Xylitol, α-Cyclodextrin, α-D-Glucose-1-Phosphate, α-Hydroxybutyric Acid, α-ketoglutaric Acid, α-ketovaleric Acid, α-methyl-DGalactoside, α-methyl-D-Glucoside, α-Methyl-D-Mannosid, β-Cyclodextrin, β-ydroxybutyric Acid, β-Methyl-DGalactoside, β-Methyl-D-Glucosid, γ-Hydroxybutyric Acid로 나타났다.

Figure.1. A phylogenetic tree showing the affiliation of 16S rDNA sequences to selected reference sequence of the heterotrophic bacteria in the soil at Gunsan Country Club. The tree was constructed from a distance matrix by the neighbourjoining analysis. The bar represents 0.02% estimated sequence divergence.

 BIOLOG Microplate를 이용하여 토양 및 잔디예초물에서 분리된 균들의 탄소원 이용패턴은 분석할 수 있었지만 이용된 탄소원들과 군산 CC의 토양 및 잔디예초물과의 직접적인 상관관계는 추가적으로 연구가 필요하다고 사료된다. BIOLOG Microplate는 균주 및 군집별 탄소원 이용도를 분석하는데 있어 매우 유용한 방법이지만 균주동정과 관련된 database가 아직은 제한적이어서 16S rDNA를 통한 동정방법에 비하여 비교적 정확성이 다소 떨어진다(이 등, 2004). 하지만 BIOLOG Microplate는 균주 및 군집 간 탄소이용패턴 비교 및 생리·대사적 변화 등과 관련된 정보를 제공하므로 생태학적인 측정에 의의가 있다고 볼 수 있다(Garland and Mills, 1994; Winding, 1994).

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